活體病毒可做疫苗，是真還是假？

2016年12月2日，國際頂級期刊Science刊登了北京大學藥學院天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室主任周德敏教授/張禮和院士課題組題為“Generation of Influenza A Viruses as Live but Replication—Incompetent Virus Vaccines”（制備復制缺陷的活流感病毒疫苗）的突破性研究進展。北京大學周德敏教授實驗室的博士研究生司龍龍、徐歡為共同第一作者。

這一研究成果在改變現有的疫苗研發、生產體系方面具有極大地潛力。通過在天然病毒株遺傳序列中引入過早終止密碼子，使得改造后的病毒在普通細胞中喪失復制增殖能力，但卻保留完全的感染活性。研究者利用這種完全活性的病毒制作疫苗，能夠有效誘發強大的體液、粘膜以及免疫T細胞介導免疫反應應對抗原性病毒，甚至能中和已受感染者體內存在的病毒株。這種疫苗技術有望成為一種應對幾乎所有病毒的普適性方法，特別是全球眾多致命性病毒。

工作原理：將活體病毒作為疫苗

在保留病毒完整結構和感染力的情況下，使流感病毒由致命性傳染源變為了預防性疫苗。這一技術不僅使疫苗研發不再復雜，而且擺脫了對病毒生物學知識獲得的依賴，並適用於幾乎所有病毒。多數評論認為，這一發現顛覆了病毒疫苗研發的理念，成就了活病毒疫苗的重大突破。

“現在的疫苗研發與生產技術復雜，而且是不通用的，比如說做流感疫苗的技術不能用在其他病毒的疫苗上面。”司龍龍說，這種病毒個體差異導致的疫苗研發技術的復雜性阻礙了其發揮更好的作用。

而周德敏教授的課題組所取得的技術突破，就是使得疫苗的研發技術獲得普適性，同時增強疫苗的效用。周德敏說，課題組以流感病毒為模型，發明了人工控制病毒復制從而將病毒直接轉化為疫苗的技術，即“在保留病毒完整結構和感染力的情況下，使流感病毒由致命性傳染源變為了預防性疫苗”。這一技術不僅使疫苗研發不再復雜，而且擺脫了對病毒生物學知識獲得的依賴，並適用於幾乎所有病毒。多數評論認為，這一發現顛覆了病毒疫苗研發的理念，成就了活病毒疫苗的重大突破。

“以（甲型）流感病毒為例，我們在改流感病毒中的信使RNA中引入了一個‘終止密碼子’，並保留病毒的完整結構。這樣，保留了感染性的病毒進入生物體后，可以激活生物體細胞的全部免疫反應﹔但由於終止密碼子的存在，病毒無法進行蛋白質翻譯，因而失去復制能力。”周德敏說。

周德敏團隊利用活體禽流感病毒制作疫苗，並進行了包括小鼠、荷蘭豬和白鼬在內的疫苗接種動物實驗。病毒入侵宿主后，不會發生復制增殖，卻可以誘導集體產生對抗該病毒的免疫能力。

關鍵步驟：切斷病毒的復制程序

在病毒的遺傳密碼中引入終止密碼子，就像是電腦需要執行一個程序，需要各種程序文件，研究人員在其中插入一個終止程序的文件，一旦程序走到這一步，就會停止，復制也就無法進行。

制作疫苗，首先是要阻斷病毒強大的自我復制能力。無論是目前常見的滅活疫苗還是減毒活疫苗，最基本的要求就是病毒在進入生命體之后，不能復制或者低水平復制。

同樣，該項研究所使用的病毒，也要採取手段切斷其復制程序，即通過在病毒的遺傳密碼中引入終止密碼子，使得病毒在進入人體之后，隻能發揮疫苗的作用，而不能作為病毒橫行肆虐。

據司龍龍介紹，部分病毒是RNA病毒，即它們的遺傳物質是RNA，“DNA是雙鏈結構，RNA一般是單鏈結構，所以RNA沒有DNA結構穩定，且RNA復制酶沒有校正功能，更容易發生突變，這也是病毒為什麼會很快發生突變的原因。”

病毒的信使RNA（mRNA）負責合成蛋白質，其中三個相鄰的鹼基構成一個密碼子，病毒通過密碼子的序列合成蛋白質並完成復制。而在這些密碼子中，有一類特殊的終止密碼子，它們的作用是終止蛋白質的合成，病毒一旦無法完成蛋白質的合成，就無法復制。實際上，一個病毒如果想要完成復制，就像是電腦需要執行一個程序，需要各種程序文件，研究人員在其中插入一個終止程序的文件，一旦程序走到這一步，就會停止，復制也就無法進行。

制作疫苗：通過轉基因細胞生產病毒

終止密碼子相當於給病毒上了一把鎖。想要將鎖打開，讓病毒恢復自我復制能力，需要三把鑰匙同時發揮作用，但在人體中，這三把鑰匙都不存在。隻有在我們自主研制的細胞系裡，病毒才會開啟復制開關。

整個研究成果實際上包含了病毒復制能力的整套“開關”程序。關閉程序保証了病毒在進入生物體內不能“作孽”，開始程序則要解決該類活體病毒疫苗的生產問題。

課題組成員，北京大學天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室博士后李帥說，早在6年前，周德敏就主持了一個國家973項目——《基於基因密碼子擴展的蛋白質標記新方法》，該研究成果的核心部分就是運用了這種改造密碼子翻譯技術，並將這種技術引入病毒體內改造病毒進而開創了新的病毒疫苗設計體系。

開啟已經插入終止密碼子病毒復制程序的就是這項“基因密碼子擴展技術”。

周德敏說，通過該項技術，建立了他們自主研發的疫苗“生產工廠”——位於北京大學天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室的病毒包裝細胞系，該細胞系被人工改造過，提供病毒復制的必要條件。“終止密碼子相當於給病毒上了一把鎖。想要將鎖打開，讓病毒恢復自我復制能力，需要三把鑰匙同時發揮作用：非天然氨基酸、與這類氨基酸匹配的轉運RNA（tRNA）以及tRNA合成酶。在人體中，這三把鑰匙都不存在，因此不會對人體產生負面影響。隻有在我們自主研制的細胞系裡，病毒才會開啟復制開關，從而可以復制出大規模的帶有終止密碼子的病毒，用以生產疫苗。”

“已經插入了終止密碼子的病毒，隻有在我們提供的這個條件中才可能完成復制，並且復制之后的病毒仍然帶有終止密碼子，在生物體內仍然無法復制。”司龍龍說。

新技術用於臨床路還很遠

中科院病原微生物與免疫國家重點實驗室研究人員孟頌東表示，周德敏團隊的研究是一種“全新的、前所未有的方法”，為對抗病毒指明了新路。然而，他同時也表示，這種人工改造的病毒有可能發生意外的突變，打破原本對其自我復制性的限制，這將帶來不可估量的后果，尤其是RNA病毒本身的極易突變特性帶來的風險。

外界的另一個擔心是，一旦改造后的病毒與天然株病毒之間發生遺傳重組，會不會發生更可怕的事情，至少目前實驗來看，這種情況還沒有發現，甚至有更為有趣的發現，即被插入了終止密碼子的病毒“感染”了天然株的病毒，使得天然株病毒也帶有了終止密碼子，失去了本身的復制能力。

周德敏對此解釋道：“病毒一直在進行重組。我們的活病毒疫苗進入人體后，如果體內同時存在感染的病毒，它們之間會重組，帶終止密碼子的病毒基因會進入野生病毒的基因中。隻需要一個終止密碼子，野生病毒就會失去復制能力。如果流感疫苗裡設置的終止密碼子越多，它們能中和的病毒數量就越多，也就是說藥性越強。”在周德敏看來，如果未來爆發大規模的病毒疫情，運用這種方法，人們可以在短時間內生產出大量針對性藥物。

“整個研究所帶來的是一種理念的變化，首先是多學科的交叉，其次，這裡面的多項技術都可能推動各自領域的發展，比如基因密碼子擴展技術對於基因藥物的研發可能會帶來很大的推動作用。”李帥說。

目前，周德敏已經為該技術申請了專利。盡管目前的動物試驗十分成功，但周德敏表示，他還不清楚針對該項目的臨床試驗何時能夠得到批准，“因為這是一項全新的研究，政府機構需要對此保持慎重的態度。或許將來的臨床試驗會出現新的問題，現在還難以判斷。”

1. 通過在病毒RNA中插入終止密碼子（UAG），改造病毒。

2. 這枚細胞是研究組通過基因密碼子擴展技術所制造的細胞系的特殊細胞，當病毒的復制程序打開，並且閱讀到終止密碼子位點時，細胞會提供人工氨基酸UAA，讓程序繼續進行，完成復制，從而可以復制出大規模的帶有終止密碼子的病毒，用以生產疫苗。

3. 另一方面，在人體正常細胞內，由於缺乏非天然氨基酸、與這類氨基酸匹配的轉運RNA（tRNA）以及tRNA合成酶，病毒無法完成復制，即不會對人體產生負面影響。

4. 插入了終止密碼子的病毒與野生株病毒進行基因重組之后，會產生同樣攜帶終止密碼子的病毒，其復制能力也會喪失。（記者 王騰騰）